2020年7月29日，美高梅登录正网黄超兰团队，中科院上海生化与细胞所许琛琦团队、美国加州大学圣地亚哥分校惠恩夫团队，联手在国际知名学术期刊Cell上发表了题为“Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的论文，该研究通过开发基于质谱的绝对定量蛋白质组新方法，揭示了T细胞受体-共受体（TCR-CD3）复合物酪氨酸在不同抗原刺激下的动态磷酸化修饰全貌，解析了不同CD3链ITAM结构域磷酸化特征的奥秘，从中发现了其中一条亚基CD3ε的单磷酸化新功能，有望助力于设计全新的CAR-T疗法。

TCR-CD3复合物在T细胞的发育、激活及对病原的免疫反应中起着决定性作用。这一重要作用来自于CD3链胞内端的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif-ITAM)及其磷酸化状况。深入探索 CD3 ITAM的酪氨酸动态磷酸化模式可为全面理解不同CD3链的功能提供核心信息及其在构建CAR-T细胞疗法的意义。 为了精确绘制出TCR-CD3受体复合物10个ITAM上的20个磷酸化位点的修饰动态过程，黄超兰团队开发了一种新颖的绝对定量方法Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass Spectrometry（TIMLAQ-MS）。区别于目前报道的蛋白组绝对定量手段，此方法不需要加入同位素重标的合成肽段，而是巧妙地利用串联质量标签（TMT），设计将6个标准样品和4个分析样品混合起来；用数据依赖采集（Data-dependent acquisition, DDA）结合平行反应监测（Parallel reaction monitoring, PRM）的方式获得抗原刺激下，TCR-CD3免疫沉淀（IP）复合物中不同酪氨酸位点的磷酸化/非磷酸化在不同时间点的定量结果。TIMLAQ 成功绕过了以前的定量方法中通常使用的同位素重标记肽，既节约了成本，又有效降低了方法的复杂性和数据采集误差，进一步提高了定量准确性，最终可完全实现在一次测量中对不同时间点全部ITAM磷酸化修饰的绝对定量，描绘TCR-CD3复合物的酪氨酸动态磷酸化修饰全貌。

基于TIMLAQ-MS法的CD3 ITAM磷酸化修饰鉴定

利用这一方法鉴定到在不同的TCR刺激条件下，CD3各亚基主要表现为双磷酸化修饰模式，而唯独CD3ε则呈现出单磷酸化修饰模式。这一特殊的新发现驱使作者进一步深入探索CD3ε在TCR通路中的新潜在功能。结果显示，单磷酸化的CD3ε可通过专门募集抑制性Csk激酶减弱TCR信号传导，说明TCR中既有激活基元又有抑制基元，总体呈现为一种自制的信号传导机制。作者团队进一步深入研究，发现一旦将CD3ε细胞质结构域整合到第二代CAR中，CD3ε的ITAM结构域可以通过募集Csk减少CAR-T细胞因子的产生，而CD3ε的BRS结构域则可以通过募集p85促进CAR-T细胞的持久性。 总体而言，将CD3ε应用于CAR的设计可显著提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。

     从一个重要的基础生物学问题开始，为解决问题而开发一个新颖方法，得到新发现，再深入探索生物学功能，最后有望贡献在治疗方法上。黄超兰教授，许琛琦教授和惠恩夫教授作为本文的共同通讯作者，完美地演绎了不同交叉领域共同合作而产生的精彩结果。

原文链接：https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0092-8674%2820%2930883-7

【延伸阅读】：

作者简介：

      黄超兰教授是美高梅登录正网精准医疗多组学研究中心主任，美高梅登录正网基础医学院长聘副教授，北大-清华生命科学联合中心研究员，曼彻斯特大学荣誉教授。黄教授长期致力于质谱技术开发及蛋白质组学在基础和临床科研中的方法学研究。首次鉴定了体内精氨酸化修饰底物并揭示其生物学功能，开启了整个精氨酸化的研究领域。此外，黄教授与浙江大学方群教授合作在单细胞蛋白组学分析研究中取得突破性进展，迄今为止，在单一体细胞中鉴定的蛋白数量是全球领域最高水平。目前已累计发表SCI论文80余篇，包括Science, Nature, PNAS等。

(美高梅登录正网精准医疗多组学研究中心)